K a t e d r a   M i k r o b i o l o g i i   P G                                                                                                                                                          Polski                    English





     Strona główna
     Skład osobowy
     Informacje o katedrze
     Informacje o zespołach 
     Informacje dla studentów
    
Specjalistyczna aparatura
     Ważne informacje       
     Archiwum prac dyplomowych
     Archiwum prac doktorskich
     Ciekawe linki
























































































































































































































































































 

Antybiotyki:

Antybiotyki są to substancje działające hamująco na procesy ważne dla życia drobnoustrojów. Poznano już około dwóch tysięcy substancji antybiotycznych wytwarzanych przez bakterie, pleśnie, grzyby, poro­sty, glony, rośliny wyższe i zwierzęta. Większość antybiotyków jest wytwarzana przez drobnoustroje zaliczane do promieniowców, pleśni i laseczek. Niektóre antybiotyki udało się otrzymać całkowicie synte­tycznie (chloramfenikol), inne zaś półsyntetycznie (ampicylina, kloksacylina, dikloksacylina).

Antybiotyki obejmują niemal wszystkie struktury chemiczne. Zasto­sowanie kliniczne znalazło dotychczas około 150 antybiotyków o róż­nym zakresie działania. Podział produkowanych antybiotyków według ich praktycznego działania przedstawiono w tabeli 2. Spośród antybiotyków wyróżniamy takie, których zakres działania jest duży, to znaczy działają na drobnoustroje należące do różnych ro­dzajów i rodzin, lub też antybiotyki działające tylko na nieliczne ga­tunki lub grupy drobnoustrojów. Szczepy należące do tego samego ga­tunku mogą być w różnym stopniu podatne na działanie antybiotyku.

Szczepy, na które antybiotyk działa, w stężeniach łatwo osiągalnych w surowicy krwi i w tkankach, nazywamy wrażliwymi, w przeci­wieństwie do szczepów opornych, niewrażliwych na działanie anty­biotyku. Szczepy wrażliwe mogą w pewnych warunkach nabywać opor­ność. Zdolność do nabywania oporności należy do zjawisk niepożąda­nych i stanowi jeden z najpoważniejszych problemów leczenia anty­biotykami. Rozwój oporności zachodzi z różną łatwością u rozmaitych drobnoustrojów, np. bardzo łatwo u gronkowców i pałeczek ropy błę­kitnej, trudno u dwoinek rzeżączki i niektórych paciorkowców. Szyb­kość powstawania oporności na różne antybiotyki nie jest jednakowa.

Tabela 2 Podział produkowanych antybiotyków według praktycznego zakresu ich działania (wg Kuryłowicza i Kowszyk-Gindifer)

Antybiotyk

Szeroki zakres działania

Aktynospektacyna, aminozydyna, cefalosporyna, cefalorydyna, cefalotyna, chloramfenikol, streptomycyna, dwuhydrostreptomycyna; Grupa neomycyn: neomycyna, kanamycyna, glutamycyna, higromycyna; Makrolidy: erytromycyna, oleandomycyna, spiramycyny, leukomycyna, linkomycyna; Penicyliny: penicylina G, penicylina V, ampicylina, kloksacylina, metycylina, dikloksacylina, nafcylina, oksacylina, fenetycylina; Peptolidy: etamycyna (gryzeowirydyna, wirydogryzeina), mikamycyny, ostreogrycyny, prystynamycyna, stafilomycyny, streptograminy, wernamycyny; Ryfamycyna SV, nizyna; Tetracykliny: tetracyklina, oksytetracyklina, chlorotetracyklina, deklomycyna, tiolutyna, tiostrepton

Gram- -dodatnie

Amfomycyna, fucydyna (kwas fusydowy), gramicydyna S, nowo-tiocyna, termorubina, tyrotrycyna, wankomycyna

Prątki

Cykloseryna, wiomycyna, kapreomycyna

Gram- -ujemne

Kolistyna, polimiksyna B

Grzyby

Polieny makrolidowe: amfoterycyna B, kandycydyna B, filipina, hamycyna, leworyna, nystatyna, trychomycyna; Polieny niemakrolidowe: wanotyna, fumagilina; Niepolieny: antelmycyna, boromycyna, cykloheksimid (aktydion), gryzeofulwina, pirolonitryna, wenturycydyna

Nowotwory

Aktynomycyny, rubomycyna (daunomycyna, rubidomycyna), mitomycyna, bruneomycyna (streptonigryna, rufomycyna), oliwomycy­ny (chromomycyny, mitramycyna)


Mechanizm działania antybiotyków

Silne działanie przeciwdrobnoustrojowe antybiotyków stało się przy­czyną badania mechanizmów tego zjawiska. Poznane mechanizmy dzia­łania okazały się zróżnicowane. Procesy fizykochemiczne mogą być ha­mowane lub zaburzane aż do zakłócania ciągów metabolicznych. Uszka­dzane mogą być procesy swoiste dla drobnoustrojów lub" wspólne dla bakterii i makroustrojów. W pierwszym przypadku antybiotyk jest nie­toksyczny, w drugim mniej lub bardziej toksyczny. Są antybiotyki inter-ferujące z syntezą białek, puryn, kwasów nukleinowych, przemianami aminokwasów lub peptydów. Miejscem działania może być ściana ko­mórkowa, na którą działają penicyliny, cefalosporyny, cykloseryna, bacytra cyna i wankomycyna (ryć. 8). Strukturę błony cytoplazmatycznej zaburzają: polimiksyna B, kolistyna i gramicydyna. Na syntezę białka zachodzącą w strukturach plazmatycznych wpływają tetracykliny, chlo-ramfenikol, streptomycyna, gentamycyna, neomycyna i erytromycyna. Na syntezę DNA i RNA działają: kwas nalidyksowy i aktynomycyna.

Ryć. 8. Podział antybiotyków według ich mechanizmu działania: 1 — antybiotyki wpływające na replikacje informacji genetycznych: kwas nalidy-ksowy, gry zeof lawina; 2 — antybiotyki zaburzające przekazywanie informacji genetycznych w biosyntezie: chloramfenikol, erytromycyna, kanamycyna, streptomycyna, tetracykliny, linnomycy-na, neomycyna-, 3 — antybiotyki uszkadzające strukturą i czynność bakteryjnej ściany komórkowej: penicyliny, cykloseryna, rystocetyna, cefalosporyny, wankomycyna, bacytracyna-, 4 — antybiotyki powodujące zaburzenia czynności błony komórkowej: gramicydyna, polimiksyna B, amfoterycyna B, tyrotrycyna, kolistyna, nystatyna.


Oporność drobnoustrojów na antybiotyk

W roku 1939 MacLean, Rogers i Fleming zaobserwowali rozwój szczepu gronkowca opornego na sulfonamidy u pacjenta leczonego sulfapirydy-ną. W roku 1941 Abraham i wsp. otrzymali szczepy gronkowców opor­ne na penicylinę in vitro. W ciągu następnych kilku lat opisano powsta­wanie szczepów opornych na streptomycynę, chloramfenikol i antybio­tyki tetracyklinowe. Obecnie znaczny procent szczepów jest oporny na sulfonamidy i antybiotyki stosowane w lecznictwie. Stwierdzono również, że prawie wszystkie gatunki drobnoustrojów mogą dawać szczepy oporne na antybiotyki i sulfonamidy. W miarę wzrostu zużycia antybiotyków i sulfonamidów w lecznictwie wzrastała liczba szczepów opornych.

Mueller, porównując wyniki leczenia rzeżączki w Stanach Zjedno­czonych stwierdził, że w latach 1940—1941 przy użyciu sulfonamidów można było wyleczyć około 70% pacjentów w porównaniu z 30% w la­tach 1944—1945. Kryński i wsp. stwierdzili w roku 1957, że ponad 95% gronkowców wyizolowanych z materiałów klinicznych i pozaklinicznych było opornych na sulfonamidy. W tym samym okresie w mate­riałach klinicznych szpitali woj. gdańskiego zaobserwowano około 73% szczepów gronkowców opornych na penicylinę, 35% na streptomycynę, 24% na chloramfenikol i około 12% gronkowców opornych na aureomy-cynę. W latach sześćdziesiątych nastąpiło szybkie zwiększenie oporno­ści wśród pałeczek Gram-ujemnych. Obecnie izolowane ze środowiska szpitalnego szczepy Pseudomonas aeruginosa są niemal wszystkie opor­ne na dostępne antybiotyki. Wzrósł odsetek szczepów opornych Kleb-siella pneumoniue, Escherichia coli, Flayobacterium, Enterobacter i innych pałeczek Gram-ujemnych.

Problem oporności szczepów drobnoustrojów zaczyna nabierać coraz większego znaczenia, zmuszając służbę zdrowia do intensywnego poszu­kiwania środków zaradczych. Starając się zapobiec dalszemu przyrosto­wi szczepów opornych, ogranicza się stosowanie antybiotyków do przy­padków koniecznych i tylko pod kontrolą lekarza. Ogranicza-się rów­nież wolną sprzedaż antybiotyków, stosowanie ich w kosmetyce i w ży­wieniu zwierząt. W USA i w Anglii ogranicza się liczbę stosowanych antybiotyków. Po pewnym czasie zarzuca się stosowane dotychczas antybiotyki, wprowadzając na ich miejsce nowe, dotąd nie stosowane. Innym rozwiązaniem jest wykorzystywanie uzupełniającego się działanią antybiotyków. Polega to na podawaniu np. dwóch antybiotyków równocześnie, przy czym każdy z nich działa na inne procesy komórko­we drobnoustrojów. Tego rodzaju działanie ma na celu utrudnienie roz­woju szczepów opornych. Na ograniczenie przyrostu szczepów opor­nych istotny wpływ ma stosowanie antybiotyków z jednoczesnym kon­trolowaniem wrażliwości drobnoustrojów in vitio. Szczepy wyizolowa­ne od chorego są poddawane oznaczeniu oporności na antybiotyki sto­sowane w leczeniu. Poznanie oporności szczepu pozwala zastosować antybiotyki, które powinny dać najlepszy skutek leczniczy i określa zarazem dawkę antybiotyku.

Wzrastająca częstość występowania szczepów opornych uniemożliwia lekarzowi wybór właściwego antybiotyku bez oparcia na wynikach ba­dań laboratoryjnych. Oznaczenia wrażliwości drobnoustrojów przepro­wadza się in vitro, posługując się zwykle metodami rozcieńczeniowymi lub dyfuzyjnymi.

Metody rozcieńczeniowe są dokładniejsze niż metody dyfuzyjne — umożliwiają wyrażenie stopnia wrażliwości w wartościach tzw. MIC i MBC.

MIC (minimal inhibitory concentration) — jest to najmniejsze stę­żenie antybiotyku hamujące wzrost drobnoustrojów.
MBC (minimal bactericidal concentration) — odpowiada najmniej­szemu stężeniu antybiotyku działającemu bakteriobójczo.

Do najczęściej stosowanych metod rozcieńczeniowych zaliczamy metodę probówkową i płytkową. W metodzie probówkowej antybiotyk rozcieńcza się w do­wolnym stosunku — podłożem bulionowym o specjalnym składzie, pod­czas gdy w metodzie płytkowej używa się do tego celu upłynnionego podłoża agarowego lub innego. Badane szczepy posiewa się do odpo­wiedniego podłoża bulionowego. Wyrosłą hodowlę rozcieńcza się 1:1000 i w określonych ilościach dodaje do każdej probówki lub posiewa na powierzchni serii płytek z agarem, zawierających malejące stężenia antybiotyku. Posiane próbki są inkubowane przez 18 godzin w temp. 37°C (nie dla wszystkich drobnoustrojów), po czym dokonuje się odczy­tu. Zmętnienie lub osad w bulionie świadczy o wzroście bakterii, bu­lion przejrzysty oznacza zahamowanie rozwoju drobnoustrojów. Naj­wyższe rozcieńczenie antybiotyku, w którym nie wystąpił wzrost, przyj­mujemy za wartość MIC. Określona wartość jest tym bardziej zbliżona do rzeczywistej, im stosunek rozcieńczeń jest mniejszy. W metodzie płytkowej wartości MIC ustalamy analogicznie na podstawie określenia najmniejszego stężenia hamującego rozwój drobnoustrojów na agarze. Metoda płytkowa ma pewne zalety. Posługując się tą samą serią płytek, można oznaczyć jednocześnie wrażliwość kilkunastu szczepów, a do­danie krwi (drobnoustroje bardziej wymagające) nie utrudnia odczytu.

Metody rozcieńczeniowe nie należą jednak do metod najczęściej sto­sowanych. Przyczyną jest brak standardów antybiotyków, znaczna pra­cochłonność, konieczność posiadania dokładnych wag i sporej ilości szkła.

Dlatego w laboratoriach bakteriologicznych powszechnie stosuje się metody dyfuzyjne, w których używa się głównie krążków bibuło­wych wysyconych znaną ilością antybiotyku. Rzadko używane są w tym celu cylinderki. Zasada metody krążkowej polega na dyfuzji anty­biotyku z krążka do żelu agarowego i działaniu na komórki wysianego szczepu. Dyfundujący antybiotyk powoduje powstanie dookoła krążka strefy zahamowania wzrostu proporcjonalnej do stopnia wrażliwości szczepu (rys. 2).


Rys. 2. Oznaczenie wrażliwości szczepów na antybiotyki metodą dyfuzyjną za pomocą krążków bibułowych

Oznaczenia powinno się prowadzić według propozycji Komitetu Ekspertów Światowej Organizacji Zdrowia na podłożu Muellera-Hinto-na (B—12). Jałowe podłoża rozlewa się na płytki Petriego o średnicy 100 mm. Grubość agaru na płytce powinna wynosić 4 mm ± l mm. W razie potrzeby określenia wrażliwości drobnoustrojów o zwiększo­nych wymaganiach odżywczych opisane podłoże można wzbogacić przez dodanie krwi baraniej lub końskiej albo też 0,5 g glukozy, 0,5% Bacto tryptose ,,Difco" i 0,5% wyciągu drożdżowego (B—13). Płytki przed posianiem należy podsuszyć przez 30 minut w temp. 37°C. Na­stępnie przygotowuje się rozcieńczenia 18—24-godzinnej hodowli bu­lionowej badanego szczepu. Dobrze rosnące pałeczki Gram-ujemne i większość ziarniaków rozcieńcza się 1:1000. Hodowle paciorkowców, dwoinek zapalenia płuc, drożdżaków należy rozcieńczyć 1:20. Jeden ml tak przygotowanej zawiesiny przenosi się na powierzchnię podsu­szonego podłoża, zbierając nadmiar płynu pipetką. Jeżeli płyn z powie­rzchni podłoża został dokładnie usunięty, krążki układa się po 4 lub 5 na każdej płytce i po 30 minutach wstawia do cieplarki o temp. 37°C. Wstępny okres 30 minut preinkubacji w temperaturze pokojowej jest zbyt krótki dla antybiotyków wolno dyfundujących. Dlatego przy ozna­czaniu tą metodą wrażliwości na polimiksynę B i kolimycynę okres preinkubacji prowadzonej w temperaturze 4°C powinien trwać 18 godzin. Czas inkubacji w cieplarce zazwyczaj wynosi 18—24 godziny. Wyjątek stanowią drobnoustroje rosnące powoli, dla których koniecz­na jest dłuższa inkubacja. Po zakończeniu inkubacji mierzy się średnicą stref zahamowania (np. za pomocą cyrkla) i podaje w milimetrach. Rów­nolegle należy zawsze prowadzić oznaczenie wrażliwości szczepu wzor­cowego.
Pomimo prostoty oznaczania wrażliwości metodą krążkową wymaga ona bardzo starannego wykonania i przestrzegania przepisów.

Użycie niewłaściwego podłoża, zmiana wielkości posiewu, pominięcie okresu preinkubacji, inne pH, pominięcie kontroli ze szczepem wzorco­wym są często przyczynami zmiany wielkości strefy i tym samym mogą być powodem fałszywego określenia wrażliwości. Ważny element uzyskania właściwego wyniku w metodzie krążko­wej stanowi odpowiednia zawartość antybiotyków w krążkach. Komi­tet Ekspertów postuluje użycie standardowych krążków o średnicy 6 mm i optymalnej zawartości antybiotyków.

Ustalona ilość antybiotyków zapewnia możliwie największą zgodność wyników uzy­skiwanych w metodzie krążkowej z wartościami MIC otrzymywanymi w metodzie rozcieńczeniowej, probówkowej lub płytkowej. To z kolei umożliwia odnoszenie wyników do średniego poziomu antybiotyku przy normalnym dawkowaniu. Na podstawie wyników badania wrażliwości szczepy można zróżnicować na cztery grupy. Do grupy pierwszej są za­liczane szczepy o bardzo dużym stopniu wrażliwości. Zakażenia wywo­łane przez takie szczepy mogą być wyleczone przy normalnym dawkowaniu antybiotyku. Szczepy grupy II są mniej wrażliwe i wyleczenie można uzyskać stosując duże dawki antybiotyku, natomiast do grupy III zalicza się szczepy, na które antybiotyk będzie działał skutecznie tylko w niezwykle dużych stężeniach, jakie można uzyskać np. w le­czeniu miejscowym, lub też jeżeli zachodzi fizjologiczne zagęszczenie antybiotyku, np. w moczu. Grupę IV stanowią szczepy oporne. Określenie wrażliwości szczepów na antybiotyki pozwala zatem na przewidywanie skuteczności antybiotykoterapii.

Mikrobiologiczne metody określania aktywności antybiotyków

Zdolność hamowania przez antybiotyki wzrostu wrażliwych drobno­ustrojów została wykorzystana do ich ilościowego określania. Do naj­częściej stosowanych metod biologicznych należą: metoda cylinderkowa i metoda seryjnych rozcieńczeń. Metodami tymi można określić aktywność antybiotyku (tj. liczbę mikrogramów czynnej substancji w l ml roztworu) i obliczyć moc preparatu (tj. liczbę mikrogramów aktywnego antybiotyku w l mg substancji).

Metoda cylinderkowa

Metoda cylinderkowa jest metodą dyfuzyjną. Do oznaczeń używa się metalowych, szklanych lub porcelanowych cylinderków (bez dna) wykonanych ze srebrnej stali, szkła pyreksowego lub porcelany glazurowanej.

Oznaczenie stężeń antybiotyków za pomocą metody płytek z cylinderkami

Cylinderki mają znormalizo­wane wymiary: 10 mm wysokości, 8 mm średnicy. Do oznaczania mocy antybiotyku używa się podłoża agarowego o specjalnym składzie (B— 14). Badania przeprowadza się na płytkach Petriego, zazwyczaj o śred­nicy 100 mm i wysokości 20 mm. Do płytek nalewa się najpierw po 21 ml upłynnionego podłoża agarowego, a po zestaleniu nawarstwia się po 4 ml podłoża agarowego, do którego dodano odpowiednią ilość ko­mórek szczepu wzorcowego. Po zestaleniu drugiej warstwy agaru, na każdej płytce ustawia się pięć cylinderków, które napełnia się roztwo­rami antybiotyku o znanych odpowiednich stężeniach i właściwie roz­cieńczone roztwory badanego antybiotyku. Następnie płytki z cylinderkami inkubuje się w odpowiedniej temperaturze. Antybiotyk, dyfundując poprzez żel agarowy, powoduje zahamowanie wzrostu wzorcowego drobnoustroju dookoła cylinderków. Wielkość strefy zahamowania wzrostu jest zależna od stężenia antybiotyku w próbce. Porównanie średnicy stref zahamowania wzrostu dookoła cylinderków, zawierają­cych roztwory antybiotyku o znanych stężeniach, ze strefami zahamo­wania wzrostu próbek badanych pozwala obliczyć (z krzywej wzorco­wej) zawartość antybiotyku w próbce. Zależnie od rodzaju badanego antybiotyku do tych oznaczeń używać należy różnych drobnoustrojów wzorcowych. Na przykład do miarecz­kowania penicyliny, wankomycyny, rystocetyny używa się szczepu Staphylococcus aureus ATCC 6538, do oznaczania mocy antybiotyku przeciwgrzybowego kandycydyny należy posługiwać się szczepem Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, a dla streptomycyny — szczepem Bacillus subtilis ATCC 6333.

Czas i temperatura inkubacji płytek z cylinderkami zależą od właści­wości antybiotyku i intensywności wzrostu szczepów. Oznaczając moc antybiotyków szybko dyfundujących, można płytki umieścić w cieplarce natychmiast po napełnieniu cylinderków. Jeżeli antybiotyk dyfunduje powoli, to próbki przed wstawieniem do cieplarki powinny po­zostać przez określony czas w temperaturze niskiej. W przypadku dro­bnoustrojów szybko rosnących wystarcza 18-godzinny czas inkubacji, podczas gdy wolniej rosnące, np. grzyby, należy inkubować odpowie­dnio dłużej.

Metoda seryjnych rozcieńczeń. W tej metodzie w dwóch szeregach pro­bówek sporządza się wzrastające rozcieńczenia antybiotyku wzorcowe­go i badanego. Jako rozcieńczalnika używa się specjalnego podłoża bulionowego, umożliwiającego wzrost używanego w badaniach szczepu wskaźnikowego (wzorcowego). Schemat przygotowania seryjnych roz­cieńczeń przedstawiono na rycinie 11. Do wszystkich probówek z wy­jątkiem kontroli dodaje się zawiesiny wrażliwego szczepu wzorcowego i próbki inkubuje przez odpowiedni czas. W probówkach, w których stężenie antybiotyku jest odpowiednio małe, występuje wzrost drobno­ustrojów, natomiast tam gdzie stężenie antybiotyku było odpowiednio duże, następuje zahamowanie wzrostu. Przykład interpretacji i zapisu wyników przedstawiono w tabeli 4. Po wstępnym badaniu, dla obu roz­tworów przeprowadza się oznaczenia dokładniejsze, zawężając rozcień­czenia do np. 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12 ........ Takie postępowanie zmniejsza błąd metody.

Schemat wykonywania rozcieńczenia seryjnego antybiotyku

Znając najmniejsze stężenie hamujące wzrost szczepu wskaźnikowe­go przez antybiotyk wzorcowy możemy określić, ile antybiotyku znaj­dowało się w l ml badanej próbki. Substancje inaktywujące antybiotyki i wywołujące zjawisko interakcji oraz sposoby ich oznaczania Znamy wiele substancji, które w zetknięciu z antybiotykami zmniejsza­ją siłę ich działania. Do znanych substancji inaktywujących penicylinę należą: penicylinaza, cysteina, kwas merkaptooctowy, chlorowodorek hydroksylaminy, sole niektórych metali ciężkich, pirydoksyna i hydro­lizat kazeiny. Substancjami, które wpływają na obniżenie działania streptomycyny są: cysteina, beta-merkaptoetyloamina i inne związki tiolowe, KOCN, chlorowodorek hydroksylaminy, hydrazyna i jej pochodne, semikarba-zydy, większość witamin rozpuszczalnych w wodzie, fenyloalanina i związki zawierające kation Mg2+. Działanie inaktywujące streptomycynę wykazuje ponadto liposytol i przesączę hodowli niektórych dro­bnoustrojów.
Antybiotyki tetracyklinowe są inaktywowane przez jony Mn2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+. Jony Mg2+ inaktywują również neomycynę. Zdolność inakty-wacji neomycyny wykazują poza tym pewne substancje wytwarzane przez komórki Pseudomonas aeruginosa.

Zdaniem niektórych autorów kwas pantotenowy, beta-alanina i L-kar-nozyna wpływają na osłabienie stopnia aktywności erytromycyny. Polimiksyny są inaktywowane przez jony Mg2+, Ca2+, mydło, liposytol oraz przez oksysteroidy. Pokrewny antybiotyk — bacylina — jest inaktywowany przez substancję tzw. antybacylinę, wytwarzaną przez niektóre drobnoustroje.

Znajomość substancji wchodzących w tzw. interakcje z antybio­tykami ma duże znaczenie dla lecznictwa, ponieważ działanie tych sub­stancji prowadzi do dezaktywacji lub zmniejszenia siły działania anty­biotyku.

Zjawisko interakcji występuje w przypadku zmieszania Chloromyce-tinum succinatum i Mephenytoinum, Erythromycinum glucoheptonatum, Hydroxyzinum hydrochloricum, Oxytetracyclinum, Tetracyclinum hy-drochloricum oraz z Yancomycinum hydrochloricum.

Erytromycyna w postaci Erythromycinum glucoheptonatum powoduje zjawisko interakcji z Chloromycetinum succinatum, Hydantoinalum, Heparinum, Luminalum Natrium, Streptomycinum sulfuricum, Tetracy­clinum hydrochloricum. Siarczan kanamycyny (Kanamycinum sulfuri­cum) wykazuje interakcję w roztworach zawierających Glucosum, Me­phenytoinum, Heparinum, Hydrocortisonum succinatum, Luminalum Na­trium i Amidoxal.

Nitrofurantoina daje interakcję z Polocainum hydrochloricum, Stre­ptomycinum sulfuricum i Yancomycinum hydrochloricum.

Interakcja zachodzi pomiędzy oksytetracykliną i lekami: Chloromyce­tinum succinatum, Benadryl, Hydrocortisonum succinatum, Luminalum Natrium, Amidoxal.

Zjawisko interakcji występuje pomiędzy penicyliną G i lekami: Me­phenytoinum, Hydroxyzinum hydrochloricum, Tetracyclinum hydrochlo­ricum, Thiopental.

Siarczan streptomycyny inaktywuje leki: Calcium gluconatoglucohe-ptonatum, Chlorothiazidum, Mephenytoinum, Erythromycinum glucohe­ptonatum, Heparinum, Nitrofurantoinum, Luminalum Natrium, Natrium hydrocarbonicum, Amidoxal.

Szczególnie wiele niezgodności występuje pomiędzy chlorowodorkiem wankomycyny i innymi lekami

W interakcji z chlorowodorkiem kanamycyny pozostają: Aminophyl-linum, Chloromycetinum succinatum, Chlorothiazidum, Mephenytoinum, Heparinum, Hydrocortisonum succinatum, Meticillinum, Nitrofuranto­inum, Penicillinum G, Luminalum Natrium, Natrium hydrochloricum, Tetracyclinum hydrochloricum, Yitaminum B complex z Yitaminum C, Yitaminum K1.

Do wykrywania substancji o działaniu inaktywującym antybiotyki stosuje się metody biologiczne, używane do oznaczania mocy antybio­tyków. Należą do nich (patrz str. 54—57): metoda cylinderkowa, meto­da krążków bibułowych, rozcieńczeń seryjnych, podwójnie stopniowa­nych płytek agarowych i turbidymetryczna.

Metoda cylinderkowa

Do wykrywania substancji inaktywujących antybiotyki i oznaczania inaktywacji konieczna jest modyfikacja tej metody. Przygotowanie pły­tek i ustawianie cylinderków nie różni się od stosowanego w metodzie miareczkowania antybiotyków. Przygotowuje się roztwory o różnych stężeniach substancji badanej i antybiotyku. Ze względu na to, że ewen­tualne przereagowanie substancji badanej z antybiotykiem wymaga czasu, pozostawiamy kolbki w temperaturze 37°C na 6 godzin. Nastę­pnie napełniamy tymi roztworami cylinderki. Do każdego badania do­łączamy kontrolę, którą stanowią wzorcowe roztwory antybiotyku oraz roztwory badanej substancji. Porównanie stref zahamowania dla roztwo­ru z samym antybiotykiem i analogicznego roztworu z substancją ba­daną pozwala wywnioskować, czy zachodzi proces inaktywacji anty­biotyku. W przypadku inaktywacji antybiotyku strefy zahamowania są tym mniejsze, im silniejsze działanie inaktywujące wywiera badana substancja. Przy bardzo silnych inaktywatorach strefy zahamowania mogą w ogóle nie wystąpić. Należy wtedy powtórzyć badania, zwięk­szając ilość antybiotyku w probówce lub zmniejszając stężenie substan­cji inaktywującej. Po odczytaniu wielkości stref zahamowania przez roztwór antybiotyku o znanym stężeniu i antybiotyku z substancją ba­daną możemy określić, jaki procent antybiotyku został zinaktywowany.

Przykład obliczania stopnia inaktywacji:

Strefa zahamowania wzrostu przez antybiotyk o mocy l j./ml = = 24 mm. Strefa zahamowania wzrostu przez antybiotyk i substancję badaną = = 19,0 mm. Z krzywej wzorcowej odczytujemy, jakiej ilości antybiotyku odpo­wiada strefa zahamowania równa 19 mm. Po odjęciu obu wartości otrzy­mujemy ilość antybiotyku, która została zinaktywowana.

Metoda krążków bibułowych

Płytki przygotowuje się tak, jak przy oznaczaniu mocy antybiotyków, z tą jednak różnicą, że dodaje się do podłoża odpowiednią ilość anty­biotyku. Po posianiu drobnoustrojów na płytkach, na ich powierzchni układa się w równych odstępach krążki bibułowe wysycone roztworem badanej substancji i jeden krążek nasycony roztworem fizjologicznym chlorku sodowego, stanowiący kontrolę. Płytki należy następnie inkubować przez 24 godziny. W przypadku braku działania inaktywującego, wzrost dookoła krążka nie wystąpi. Działanie inaktywujące spowoduje powstanie strefy wzrostu drobnoustrojów. Z wielkości strefy wzrostu możemy się zorientować o sile działania badanej substancji.

Metoda rozcieńczeń seryjnych

W metodzie rozcieńczeń seryjnych postępuje się podobnie jak przy oznaczaniu mocy antybiotyku. Przygotowuje się dwa równoległe szere­gi rozcieńczeń — jeden z antybiotykiem, drugi — z antybiotykiem i ba­daną substancją. W przypadku braku działania inaktywującego, w obu rzędach probówek zahamowanie wzrostu nastąpi w tym samym rozcień­czeniu. Jeżeli natomiast badany związek wykazuje działanie inaktywujące, to zahamowanie wzrostu w szeregu rozcieńczeń zawierającym antybiotyki i substancję badaną wystąpi w rozcieńczeniu mniejszym niż w rzędzie wzorcowym. Z wielkości przesunięcia zahamowania mo­żemy obliczyć, jaka ilość antybiotyku została zinaktywowana.

Metoda płytek podwójnie stopniowanych

W tej metodzie dodajemy do dolnego skosu agarowego substancję inaktywującą, a do górnego — antybiotyk. Na płytkę nalewa się najpierw 10 ml podłoża agarowego z badaną substancją, którą sprawdzamy, czy wykazuje właściwości inaktywujące dany antybiotyk. Podłoże na płytce pozostawia się do zestalenia w po­zycji skośnej (ryc. 12). Następnie ustawia się płytkę w pozycji poziomej i nalewa 10 ml podłoża z antybiotykiem.

Przygotowanie podwójnie stopniowanych płytek agarowych

W ten sposób na powie­rzchni płytki otrzymuje się stopniowo zmieniające się stężenia substan­cji badanej, zależnie od grubości dolnej warstwy. Po posianiu szczepu wzorcowego, wrażliwego na antybiotyk, i odpowiednim okresie inkuba­cji otrzymuje się strefę wzrostu i strefę zahamowania wzrostu. Znając wielkość strefy zahamowania wzrostu dla płytki z antybiotykiem, ale bez „inaktywatora” stwierdzamy, czy badana substancja wpływa na osłabienie aktywności antybiotyku. Jeśli substancja działa inaktywująco na antybiotyki, to strefa zahamowania wzrostu jest mniejsza niż na płytce kontrolnej.